Авторы: Хвай Вон Сео, Кивон Хан, Чангхун Парк, Чанхи Че. Национальный университет Сеула, 1 Гванак-ро, Гванак-гу, Сеул 151-742, Республика Корея.
РЕЗЮМЕ
Цель данного исследования заключалась в том, чтобы провести детальное сравнение эффективности четырех вакцин против свиного цирковируса 2 типа (PCV2) с различными типами антигенов и дозами в экспериментальных условиях на основании определенных критериев, таких как клинические (среднесуточный привес [ADWG]), вирусологических (признаки виремии), иммунологические (наличие PCV2-специфических нейтрализующих антител [NA], интерферон-γ-секретирующих клеток [IFN-γ-Scs], подгрупп клеток CD3+ и CD4+ T), а также патологические (повреждения лимфоидной ткани и баллы антигенной активности PCV2). В общей сложности, 60 трехнедельных поросят разделили на шесть групп по 10 особей в группе и вакцинировали либо 1 из 4 коммерческих вакцин, предусматривающей введение одной дозы, или не вакцинировали. После достижения животными возраста 7 недель, вакцинированных и контрольных свиней заражали интраназально при помощи введения 2 мл PCV2b. Все свиньи были умерщвлены и подвергнуты аутопсии на 25 неделе.
С 9 до 16 недели показатель ADWG у вакцинированных животных был значительно выше по сравнению с невакцинированными. Статистически значимые различия (P<0.05) были обнаружены между вакцинированными животными и животными из групп положительного контроля по логарифмически преобразованному показателю содержания ДНК PCV2b в крови и пробах, полученных при помощи тампонирования слизистой носа, логарифмически преобразованных титров NA, и PCV2-специфических интерферон-γ-секретирующих клеток на 0, 7, 14, 21, и 42 день после заражения (dpc). Доля клеток CD4+ на 7 и 14 день после заражения также значительно отличалась у вакцинированных и контрольных животных (P<0.05). Гистопатологические повреждения и баллы антигенной активности PCV2 в лимфатических узлах были значительно ниже (P<0.05) у вакцинированных животных. Все четыре вакцины продемонстрировали высокую степень эффективности при контрольном экспериментальном заражении PCV2 по использованным критериям.
Введение
Свиной цирковирус 2 типа (PCV2) является основным этиологическим агентом, вызывающим развитие целого ряда заболеваний, объединяемых в одну группу патологий под названием «заболевания, связанные со свиным цирковирусом» (PCVAD) (Chae, 2004, 2005). Из совокупности состояний, включенных в данную группу, послеотъемный мультисистемный синдром истощения (PMWS) считается наиболее важным с экономической точки зрения (Chae, 2005). С того времени как вакцины против PCV2 впервые появились на международном рынке в 2006 г., вакцинация стала основным способом контроля за распространением PCVAD. Коммерческие вакцины против PCV2 показали высокую эффективность в снижении распространенности и профилактики PCVAD как в экспериментальных, так и полевых условиях (Fort et al., 2008, 2009b; Kixmoller et al., 2008; Opriessnig et al., 2009; Segalés et al., 2009; Shen et al.,2010; Martelli et al., 2011; Fraile et al., 2012; Seo et al., 2012).
Одним из наиболее важных критериев оценки эффективности таких вакцин является снижение виремии, поскольку этот фактор играет основную роль в развитии PCVAD (Chae, 2012): уровень виремии используется в качестве критерия для разделения PCV2 инфицированных сывиней на субклинически инфицированных и PCVD-положительных (Liu et al., 2000; Brun-borg et al., 2004; Olvera et al., 2004; Segalés et al., 2005). Количественное определение вирусной нагрузки также может использоваться в качестве параметра для оценки эффективности вакцины против PCV2: снижение виремии коррелирует с наличием PCV2-нейтрализующих антител (NA), а также интерферон-γ-секретирующих клеток (IFN-γ-SCs) (Meerts et al., 2005, 2006; Fort et al., 2007, 2009a). Однако только одно исследование было посвящено оценке того, действительно ли доступные в продаже вакцины против PCV2 индуцируют специфические IFN-γ-SCs в экспериментальных условиях (Fort et al., 2009b).
В настоящее время в Корее в продаже имеются четыре однодозовые вакцины против PCV2. Это две вакцины, отличающихся по белку капсида, экспрессируемого в системе бакуловируса, а также две инактивированные вакцины, содержащие PCV2 или химерный PCV1-2. В ходе предшествующих исследований было проведено сравнение вирусологических и патологических исходов после вакцинации тремя вакцинами против PCV2, применение которых разрешено в США (Opriessnig et al., 2009; Shen et al., 2010). Цель данного исследования заключалась в сравнении эффективности четырех вакцин против PCV2 на основании соответствия определенным клиническим, вирусологическим, иммунологическим и
Таблица 1, предоставляется по запросу
Эффективность четырех коммерческих вакцин против свиного цирковируса 2 типа (PCV2) (Фостера, Цирковак, Циркофлекс и Порцилис), оцененная по таким критериям как среднесуточный привес (ADWG), признаки виремии и выделение вируса из полости носа, результаты изучения гистопатологических повреждений и иммуногистохимия антигенной активности вируса в баллах. Dpc, количество дней после заражения.
Отбор животных и протокол эксперимента
В общей сложности, 60 гибридных поросят, получавших молозиво, от девяти молодых свиней с отрицательным результатом анализа сыворотки на PCV2, были приобретены в возрасте 14 дней на коммерческой ферме, где не было случаев вирусного репродуктивного и респираторного синдрома (RRSV). Ремонтные свинки и свиноматки на данной ферме никогда не вакцинировались от PCV2, и клинические признаки инфекции, вызываемой PCV2, не были ранее зарегистрированы. Сыворотка поросят также не содержала антител к PCV2 и вирусных частиц, по данным анализа монослоя иммунопероксидазы (IPMA) и ПЦР в режиме реального времени (Gagnon et al., 2008; Fort et al., 2009b).
По достижении животными возраста 3 недель, их распределили в одну из шести групп (10 свиней/группа). Данное исследование было рандомизированным, слепым и контролируемым, при этом животные в разных группах соответствовали друг другу по весу и полу. Четыре изучаемые коммерческие вакцины против PCV2 применялись в соответствии с инструкциями производителей по возрасту вакцинации (3 недели) и пути введения (ВМ в правую части шеи): однодозовая вакцина Фостера PCV/Суваксин PCV2 (Зоетис) - 2 мл; однодозовая вакцина Цирковак (Мериал) - 0.5 мл; однодозовая вакцина Циркофлекс (Берингер Ингельхайм Ветмедика) - 1 мл, и однодозовая вакцина Порцилис PCV (Мерк, Шарп и Доме Энимал Хелс) - 1 мл. Животным из группы положительного и отрицательного контроля вводили фосфатный буфер (PBS) в дозе 2 мл.
Когда поросята достигли возраста 49 дней (0 дней после заражения [dpc]), вакцинированных животных и животных из групп положительного контроля заражали интраназально при помощи введения 2 мл PCV2b (1 мл/ноздря) Применялся штамм SNUVR000463 [номер GenBank KF871068]; 5-й пассаж; 1.0 x 105 50% инфицирующей дозы для культуры тканей/мл. Поросятам из группы отрицательного контроля вводили супернатант неинфицированных культур клеток.
Каждая группа содержалась в отдельном помещении. Пробы крови получали из шейной вены, а пробы из полости носа – при помощи тампонирования стерильными тампонами (Копан) на 28, 0, 7, 14, 21, 42, 70, 98 и 133 день после инфицирования. Все свиньи были умерщвлены после усыпления при помощи введения азаперона (Стреснил) на 133 dpc (25 недель). Все экспериментальные процедуры были одобрены Учрежденным Комитетом Национального Университета по вопросам содержания и использования животных (ссылка SNU-13021911).
Оценка роста
Живой вес каждого поросенка измеряли на 3 (вакцинация), 7 (заражение), 9, 16, и 25 неделе (аутопсия). Среднесуточный привес (ADWG, г/поросенок/день) анализировали через определенные интервалы времени, а именно, между 3 и 7, 7 и 9, 9 и 16, а также 16 и 25 неделями. ADWG в течение этих различных стадий производства вычисляли как разницу между начальным и итоговым показателями веса, которую делили на длительность стадии производства. Данные погибших животных также включали в расчеты.
Серология и количественное определение содержания ДНК PCV2 в крови и пробах, полученных при помощи тампонирования слизистой носа Анализ сыворотки проводили, используя коммерческий набор для IgG PCV2 ELISA (Синбиотикс), а также посредством нейтрализации вируса (Allan et al., 1994; Pogranichnyy et al., 2000). Пробы считались сероположительными при титре >550, в соответствии с инструкциями производителей. ДНК экстрагировали из сыворотки и проб из полости носа при помощи набора «QIA-amp DNA mini kit» (Кейген). Для количественного определения количества копий геномной ДНК PCV2 использовали экстракты, анализ проводился методом ПЦР в режиме реального времени, как описывалось ранее (Gagnon et al., 2008).
Иммунологический анализ меченого белка
Количество PCV2-специфических интерферон-γ-секретирующих клеток определяли в PBMCs на 28, 0, 7, 14, 21, 42, 70, 98, и 133 dpc, как описано в литературе (Diaz и Mateu, 2005; Seo et al., 2012). Дозы цельного вируса PCV2b (использованного для заражении) с коэффициентом 0.01 применяли для стимуляции PBMCs. Фитогемагглютинин (PHA; 10 µг/мл, Роще Диагностикс) и PBS использовались как положительный и отрицательный контроли, соответственно. Концентрация PBMCs была скорректирована до уровня 106 PBMCs/лунка. Количество интерферон-γ-секретирующих клеток было вычислено по количеству лунок после стимуляции вирусом за вычетом количества лунок без стимуляции PBS.
Проточная цитометрия
PBMCs (106 клеток/мл) инкубировали с R-PE-конъюгированными (1 µг/мл) или FITC-конъюгированными (5 µг/мл) мышиными моноклональными антителами (антисвиные CD3 [R-PE] и CD4 [R-PE и FITC]; СаузернБиотек) в течение 30 минут при 4°C в темноте и дважды промыли. Клетки, связанные с конъюгированными антителами, сразу ресуспендировали в обогащенной среде RPMI1640. Просвет канала был выбран таким образом, чтобы имелась возможность воздействовать на сортировку лимфоцитов за счет прямого/бокового рассеивания света. Базовое окрашивание учитывалось при помощи изотипных контролей, конъюгированных с FITC или PE. Анализ клеток проводили при помощи проточного цитометра FACSCalibur (Бектон, Дикинсон), как описано в литературе (Sosa et al., 2009).
Гистопатология и иммуногистохимия
Морфометрический анализ гистопатологических повреждений (Fenaux et al., 2002) и баллов антигенной активности PCV2 (Kim et al., 2009) в лимфатических узлах проводился при помощи изучения трех срезов поверхностных паховых лимфоузлов, при этом специалист, который проводил анализ, не имел сведений о том, от какой группы животных получены образцы. Баллы оценки повреждений варьировали от 0 до 3 следующим образом: 0 (отсутствие угнетения лимфоидной ткани или гранулематозного замещения); 1 (слабая степень угнетения лимфоидной ткани); 2 (умеренная степень угнетения лимфоидной ткани), и 3 (тяжелое угнетение лимфоидной ткани и гранулематозное замещение). Количество PCV2-положительных клеток на единицу площади ткани (0.25 мм2) рассчитывали при помощи программы NIH Image J 1.45s.
Статистический анализ
Изучение непрерывных данных (вычисленные значения ДНК PCV2, серология PCV2, PCV2-специфические IFN-γ-SCs, подгруппы лимфоцитов, а также ADWG) проводилось методом анализа вариант (ANOVA). Если данный тест выявлял значительное влияние, для каждой временной точки выполнялся односторонний ANOVA с попарным тестированием при помощи корректировки Тьюки (Tukey). Дискретные данные (морфологические повреждения лимфоидной ткани и баллы антигенной активности PCV2s) были проанализированы при помощи теста хи-квадрат и теста на точность Фишера. Коэффициент корреляции Пирсона (Pearson) использовался для оценки потенциальной связи между такими параметрами как виремия, титры NA, а также PCV2-специфические IFN-γ-SCs. Значение P<0.05 считалось статистически значимым.
Результаты
Особенности роста и количественное определение содержания ДНК PCV2 в сыворотке крови и пробах, полученных при помощи тампонирования слизистой носа
Не было обнаружено значительных отличий по среднесуточным привесам ни в одной из экспериментальных групп за 3–9 недель. Среднесуточные привесы у вакцинированных животных и в группах отрицательного контроля были значительно выше по сравнению с группами положительного контроля за период 9–16 недель (P < 0.05), но не после этого. В целом, особенности роста не отличались в шести изучаемых группах (Таблица 1). Не было выявлено ДНК PCV2b в крови или пробах, полученных при помощи тампонирования слизистой носа от вакцинированных животных или животных из групп положительного контроля во временной точке исследования, соответствующей 0 dpc. После этого было зафиксировано значительное различие (P<0.05) по логарифмически трансформированному показателю содержания ДНК PCV2b в крови (Рис. 1A) и пробах, полученных при помощи тампонирования слизистой носа (Рис. 1B), между вакцинированными животными и группой положительного контроля на протяжении всего эксперимента, за исключением 133 дня после заражения. Не было выявлено ДНК PCV2b в крови или пробах, полученных при помощи тампонирования слизистой носа, у животных из групп отрицательного контроля на протяжении всего эксперимента.
Серология
Были зафиксированы значительные различия (P < 0.05) по титрам анти-PCV2 IgG между вакцинированными животными и животными из групп положительного контроля во временной точке исследования, соответствующей 0 dpc: у свиней, получивших вакцины Фостера PCV и Цирковак отмечались существенно более высокие титры (P < 0.05) по сравнению с животными, иммунизированными Порцилис PCV или Циркофлекс (Рис. 2A). Не было обнаружено IgG в группах отрицательного контроля на протяжении эксперимента.
Были зафиксированы значительные (P < 0.05) различия по логарифмически трансформированным титрам NA между вакцинированными животными и животными из групп положительного контроля в дни 0, 7, 14, 21, и 42 после заражения. Кроме того, значительные различия (P < 0.05) также были отмечены между группами, получавшими разные вакцины (Рис. 2B). У вакцинированных животных и животных из групп положительного контроля логарифмически преобразованные титры NA обратно пропорционально коррелировали с количеством геномных копий PCV2 в пробах крови (r2 = 0.687 и P = 0.035 для Фостера PCV; r2 = 0.723 и P = 0.031 для Цирковак; r2 = 0.634 и P = 0.032 для Циркофлекс; r2 = 0.711 и P = 0.024 для Порцилис PCV; и r2 = 0.639 и P = 0.036 для положительного контроля).
PCV2-специфические интерферон-γ-секретирующие клетки
Было зафиксировано статистически значимое различие (P<0.05) по количеству PCV2-специфических IFN-γ-SCs между вакцинированными животными и группами положительного контроля на 0, 7, 14 и 21 dpc. Кроме того, обнаружились также статистически достоверные различия (P<0.05) между группами, получавшими разные вакцины (Рис. 2C). Как у вакцинированных животных, так и у животных из групп положительного контроля, количество интерферон-γ-секретирующих клеток обратно пропорционально коррелировало с количеством геномных копий PCV2 в крови (r2 = 0.715, P = 0.029 для Фостера PCV; r2 = 0.644, P = 0.045 для Цирковак; r2 = 0.611, P = 0.038 для Циркофлекс; r2 = 0.732, P = 0.021 для Порцилис PCV; и r2 = 0.598, P = 0.042 для группы положительного контроля).
Идентификация подгрупп лимфоцитов, гистопатология и иммуногистохимия
Было зафиксировано статистически значимое различие (P< 0.05) по доле клеток CD4+ у вакцинированных животных и животных из групп положительного контроля на 7 и 14 день после заражения. Отмечены также статистически значимые различия (P<0.05) в зависимости от введенной вакцины. На 14 день после нагрузочной пробы Фостера PCV и Цирковак индуцировали появление существенно большей доли клеток CD4+ (P< 0.05) по сравнению с другими вакцинами. На 21 день после заражения в группе введения вакцины Фостера PCV была обнаружена существенно большая доля клеток CD4+ (P<0.05) по сравнению с группой введения Порцилис PCV и группой положительного контроля (Рис. 3A). Было зафиксировано статистически значимое различие (P < 0.05) по доле клеток CD3+ у вакцинированных животных и животных из групп положительного контроля на 7 день после заражения, но не после этого.
Степень гистопатологического повреждения и баллы антигенной активности были значительно ниже (P<0.05) у вакцинированных животных по сравнению с группами положительного контроля. Однако не было зафиксировано различий между этими параметрами в группах применения различных вакцин.
Обсуждение
Результаты данного исследования доказывают эффективность вакцин против PCV2, предназначенных для однократной вакцинации, по широкому спектру клинических, вирусологических, иммунологических и патологических критериев. Уменьшение степени виремии считается наиболее важным свойством этих вакцин (Fort et al., 2008, 2009b; Opriessnig et al., 2009; Shen et al., 2010), с учетом того, что высокие уровни PCV2 ассоциируются с развитием PCVAD (Chae, 2005; Meerts et al., 2006).Интересно отметить, что нами были выявлены статистически достоверные различия между четырьмя изучаемыми вакцинами по степени, до которой они способны снижать виремию на 14 и 21 dpc. Использование инактивированных химерных вакцин PCV1-2 (Фостера PCV) и PCV2 (Цирковак) приводило к значительному снижению виремии по сравнению с использованием субъединичных (Циркофлекс и Порцилис PCV) вакцин в тех же временных точках, в этом аспекте обнаруженные данные совпадают с информацией, указанной в предшествующих отчетах (ONeill et al., 2011).
В данном исследовании только у вакцинированных животных выявлялись PCV2-специфические NA и интерферон-γ-секретирующие клетки в день заражения (через 4 недели после вакцинации). Однако были обнаружены значительные различия по способности изучаемых вакцин индуцировать специфические иммунные реакции: инактивированные химерные вакцины против PCV1-2 и вакцины против PCV2 вызывали появление более высоких уровней PCV2-специфических NA и интерферон-γ-секретирующих клеток по сравнению с субъединичными вакцинами. Эти различия, скорее всего, могут влиять на снижение виремии после использования этих вакцин. То есть, применение этих вакцин изменяет как гуморальную (NA), так и клеточно-опосредованную ответные реакции, влияя на образование интерферон-γ-секретирующих клеток и выведение вируса из организма, что, безусловно, позволяет контролировать прогрессирование инфекции. Более того, образование IFN-γ является основным фактором, влияющим на соответствующую дифференциацию CD4+ T-клеток (Schroder et al., 2004), что важно для клеточно-опосредованного иммунитета (CMI) (Saalmüller и Bryant, 1994; Schroder et al., 2004).
В полевых условиях уменьшение количество CD4+ T клеток было обнаружено у свиней с синдромом PMWS, появившимся в естественных условиях (Segalés et al., 2001). В данном исследовании повышение количества CD4+ T-клеток было выявлено только у вакцинированных животных, а это указывает на то, что вакцина стимулирует клеточно-опосредованный иммунитет. Однако требуется осторожность при интерпретации этих данных, так как увеличение процента CD4+ T клеток в популяции PBMC не обязательно отражает увеличение абсолютного количества CD4+ T-клеток на микрофотографиях видны красные иммуногистохимические маркеры антигена свиного цирковируса 2 типа (PCV2) в макрофагах лимфатических узлов свиней через 133 дня после зараженияпри использовании четырех коммерческих вакцин против PCV2, предназначенных для однократной вакцинации: инактивированной химерной вакцины PCV1-2 (Фостера PCV, A); инактивированной вакцины PCV2 (Цирковак, B); субъединичных вакцин PCV2 (Циркофлекс, C и Порцилис PCV, D); а также у животных, инфицированных PCV2 (E). Иммуногистохимическое окрашивание гематоксилином. Масштаб = 50 µм.
Морфологическая оценка степени накопления антигенов PCV2 и разрушения лимфоидной ткани в лимфатических узлах являются критически важными критериями для оценки эффективности вакцины против PCV2, так как эти свойства являются центральными для диагностики PCVAD. Оба параметра уменьшились после применения каждой изученной в данном исследовании однодозовой вакцины, эти факты подтверждают данные предшествующих исследований (Opriessnig et al., 2009; Fort et al., 2009b; Shen et al., 2010).
Отсутствие микроскопически видимых повреждений в ходе данного исследования связывали, главным образом, с большим интервалом между заражением и аутопсией: PCV2-ассоциированные повреждения начинают исчезать между 21 и 28 днями после инфицирования (Shen et al., 2010). Животные из группы серонегативного контроля/ свиньи без виремии использовались в нашем исследовании, чтобы исключить потенциальное перекрывание с материнскими антителами или естественной инфекцией PCV2. Все четыре вакцины продемонстрировали высокую степень эффективности при контролируемом экспериментальном заражении PCV2, как показало изучение соответствия полученных данных целому ряду критериев.
Выводы
Детальное изучение четырех однодозовых коммерческих вакцин против PCV2 с различным типом антигенов, с использованием всех протестированных дозировок, показало, что все четыре продукта являются высоко эффективными для предотвращения развития инфекции, вызываемой PCV2, по широкому спектру клинических,вирусологических, иммунологических и патологических параметров.
Заявление о конфликте интересов
Ни у одного из авторов этой статьи нет финансовых или личных связей с другими людьми или организациями, которые могли бы ненадлежащим образом влиять на содержание этой работы.
Поделиться в facebook